Новый коронавирус из пациентов с пневмонией в Китае
A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019
В ней описаны совершенно классические вирусологические подходы (с поправкой на развитие технологий), которые использовались для изначального выделения и характеризации этого вируса.
Началось все с того, что в клиники стали приходить люди с острой пневмонией. Им сделали бронхео-лаважи, довольно неприятные процедуры, когда через трубку в легкие вводится физраствор (или что-то похожее), и потом отсасывается обратно в надежде, что в нем будет то, что собственно и вызвало пневмонию. Жидкость протестировали на 18 известных вирусных и 4 бактериальных инфекции, безрезультатно.
Тогда из образца выделили всю присутствующую там РНК, перевели ее в ДНК, и отсеквинировав без разбора получили последовательности всего что там плавало. Полученные последовательности автоматически сравнивались со всеми известными вирусами и микробами в публично-доступных базах данных. По результатам подавляющее большинство полученных последовательностей совпали с последовательностями коронавирусов, более того - на 85% совпавших даже с конкретным вирусом ранее выделенным из летучих мышей. До появления современных методов секвинирования на подобный проект ушли бы годы, а сейчас это возможно за несколько дней.
Пользуясь этой информацией они протестировали эти образцы уже более направленно, используя праймеры нацеленные на эволюционно-консервативный кусок коронавирусов и получили положительный результат, хотя праймеры и не очень хорошо сработали (что было вполне ожидаемо).
Затем они выделили вирус. Для этого использовались культуры клеток полученных от людей проходящих операции по удалению рака легких. Полученные из них клетки сейчас умеют выращивать в специальных условиях на границе жидкости и воздуха, так что они формируют этакий искуственный легочный эпителий, который можно еще и размножать. Лаважную жидкость отфильтровали от особо крупной грязи и добавили к культурам клеток. Время от времени их слегка обмывали физ-раствором сверху (со стороны воздуха) и переносили собранную жидкость (после фильтрации) на еще незараженную культуру - стандартный способ показать инфекционную природу явления.
Через какое-то время в культуре накопилось столько вируса, что даже под световым микроскопом стали заметны его патогенные эффекты, в том числе и пропадание биения ресничек на эпителиальных клетках. На картинке это плохо видно, но в реальности должно быть куда заметней. Как оказалось такие сложные эпителиальные культуры делать было не обязательно: похожие результаты с некоторой задержкой они получили и на обычных клеточных линиях, полученных как от человека так и от обезьян.
На этой стадии образцы также отправили на электронную микрофотографию. Результаты ниже.
Слева вирус крупным планом. По краям у него видны "протуберанцы" которые и дали название этому семейству вирусов (по сходству с солнечной короной). Размер вирусных частиц довольно разнообразен - от 60 до 140 нм, т.е. примерно с вирион ВИЧ. Справа зараженная эпителиальная клетка. Треугольниками показаны реснички эпителия. Стрелочными наконечниками - вышедшие из клетки вирусы. Стрелками - внутриклеточные "мешки" с новообразованными вирусами, которые еще не вышли из клетки.
Таким образом они подтвердили что выделили коронавирус. Сравнив его полную последовательность с уже известными вирусами, они показали, что этот вирус действительно принадлежит к семейству бетакоронавирусов и близкородственнен SARS. Полученные последовательности были выложены в публичные базы данных и таким образом стали доступны ученым в любой точке планеты.